Bearbeitete wissenschaftliche Projekte

Deckblatt & Zusammenfassung der Diplom- und Promotionsarbeit,
Kurzangaben zu den nachfolgenden Projekten

Diplomarbeit

Promotion

Das Phosphorylase Kinase Projekt

Genotyping / Genanalyse

vps-Forschung

Das cDNA-Projekt

wfk-Institut für Reinigungstechnologie

Molekulare Diagnostik: Fa. Medizinisches Hochschulinstitut

Öffentlichkeitsarbeit


Ruhr-Universität Bochum
Fakultät für Biologie

Molekularbiologische Untersuchungen
am trifunktionellen ß-Oxidationsenzym
aus den katalasefreien Microbodies von
Neurospora crassa

DIPLOMARBEIT

vorgelegt von Andreas Beyer
Bochum, November 1989


V. ZUSAMMENFASSUNG

  1. Zwei von Pfitzner übernommene cDNA-Klone des TFE von N.crassa wurden in das Bluescriptplasmid umkloniert. Von diesen beiden Klonen wurden Subklone zur Sequenzierung präpariert.
  2. Der gesamte von den beiden Ausgangsklonen abgedeckte Bereich des TFE-Gens (2041 bp) wurde in beiden Richtungen durchgehend sequenziert.
  3. Fragmente der cDNA-Klone wurden als Sonde zur Isolierung genomischer TFE-Klone verwendet. Aus der zur Verfügung gestellten pBR322-Bibliothek konnte kein Klon isoliert werden.
  4. Es wurde eine Bibliothek in λ-EMBL3 erstellt. Sie hat den Umfang von 31000 unabhängigen Klonen.
  5. Aus dieser Bibliothek wurden 3 unabhängige, putative genomische TFE-Klone isoliert. Für einen jener Klone wurde durch Feinselektion und Southern-Blot-Analyse der Nachweis erbracht, daß er tatsächlich das TFE-Gen (odereinen Teil desselben) enthält.
  6. Die abgeleitete Proteinsequenz wurde mit den TFE's aus Candida tropicalis und Saccharomyces cerevisiae verglichen. Die beobachteten intramolekularen homologen Bereiche wurden als die beiden im TFE enthaltenen Hydratasen interpretiert. Auf dieser Vorstellung aufbauend wurde eine Zuordnung der verschiedenen enzymatischen ß-Oxidationsaktivitäten zu bestimmten Bereichen der TFE's aus Pilzen und dem MFE der Ratte versucht. Daran anschließend wurde eine Hypothese über die phylogenetische Entstehung der Domänenstruktur dieser Proteine entwickelt.
  7. Mit Hilfe von Konsensussequenzen für Nukleotidbindungsstellen wurden putative Substratbindestellen im TFE und MFE identifiziert.

-> zu den Publikationen


Ruhr-Universität Bochum
Fakultät für Biologie

Molekularbiologische Charakterisierung
der AAA-Genfamilie,
einer neuen Gruppe putativer ATPasen

DISSERTATION

zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften
der Fakultät für Biologie der Ruhr-Universität Bochum

angefertigt im Institut für physiologische Chemie,
medizinische Fakultät
unter der Betreuung von Prof. Dr. W.-H. Kunau

vorgelegt von Diplom-Biologe
Andreas Beyer aus Essen

V. ZUSAMMENFASSUNG

  1. In der vorliegenden Arbeit sollten Mitglieder der AAA-Genfamilie kloniert werden. Dazu wurde die Methode der Hybridisierung bei geringer Stringenz, der heterologen immunologischen Detektion und der PCR mit degenerierten Primern angewendet.
  2. Während mit den ersten beiden Methoden keine Erfolge erzielt werden konnten, wurden PCR-Varianten etabliert, die effektiv heterologe Klonierungen erlaubten.
  3. Über die PCR wurden Fragmente von Vertretern der AAA-Familie aus verschiedenen Organismen amplifiziert, kloniert und sequenziert. Auf diese Weise wurden vier gänzlich neue Unterfamilien sowie zwei neue PAS1-Vertreter identifiziert.
  4. "TESG"/AFG2 ist eine neue, über PCR entdeckte Unterfamilie in der Hefe. Es wurden minigenomische Saccharomyces cerevisiae-Bibliotheken erstellt und aus ihnen positive Klone isoliert, überprüft und ansequenziert.
  5. Eine detaillierte Sequenzanalyse erlaubte die Definition eines konservierten Bereiches in den Proteinen der AAA-Familie. Die Substruktur dieser sog. AAA-Kassette wurde untersucht und ein Sekundärstrukturmodell vorgeschlagen.
  6. Für die AAA-Familie wurden Unterfamilien definiert und deren Beziehung zueinander untersucht. Untergruppentypische Sequenzbereiche wurden identifiziert und zur Konstruktion von PCR-Primern genutzt.
  7. Aus der Homologiesuche resultierten ebenfalls neue AAA-Unterfamilien sowie ein putativ PAS8-orthologes Gen aus Mais. Aufgrund der vorliegenden Analysen gelang in Zusammenarbeit in einem anderen Labor die Klonierung eines PAS8-Vertreters aus Reis.
  8. Aus den verschiedenen Ergebnissen der Sequenzanalyse wurde ein hypothetischer Stammbaum der AAA-Familie abgeleitet.
  9. Der evolutionäre Ursprung der Microbodies wurde im Zusammenhang mit den Ergebnissen der Sequenzanalyse diskutiert.

-> zu den Publikationen


Das Phosphorylase-Kinase Projekt

Diese Arbeiten fanden statt während meiner PostDoc-Zeit (Prof. Dr. Heilmeyer, physiol. Chemie, Universität Bochum).

Speicherglycogen in Leber und Muskel wird durch das Enzym Phosphorylase phosphorolytisch zu Glucosephosphat abgebaut. Die Phosphorylase unterliegt vielfältigen regulatorischen Einflüssen, u.a. ATP-abhängigen Phosphorylierungen durch die Phosphorylase Kinase (PhosKin). Letztere dient als Signalintegrator und ist selber Substrat für etliche Proteinkinasen. In der PhosKin gibt es einen Bereich, den sog. multi-phosphorylation-loop, in dem Phosphorylierungsstellen in hoher Dicht liegen.

Untersucht wurde die Phosphorylierung der PhosKin durch die AMP-abhängige sowie die cAMP-abhängige Proteinkinase (AMPK / cAMPK). Als Substrate wurden präpariert:

Die Ergebnisse (inklusive aller Kontrollen) waren eindeutig: cAMPK phosphoryliert die PhosKin, AMPK tut das nicht. Damit habe ich frühere, anders lautende Berichte widerlegt.

Mit dem erfolgreichen Abschluss der Arbeiten war das Projekt beendet.

-> zu den Publikationen


Genotyping / Genanalyse

In der Zeit 1997-2003 wurden aus unterschiedlichen Anlässen verschiedene diagnostische Experimente und Prozeduren entwickelt und etabliert:

  1. Für das Praktikum "physiologische Chemie für Mediziner" an der Ruhr-Universität habe ich einen robusten und schnellen (4 Stunden von Blutentnahme bis zum Ergebnis), PCR-basierten Gentest entwickelt: Die Studenten können sich selbst untersuchen auf eine Mutation, durch die es während einer Narkose zu Komplikationen kommen kann (die sog. Maligne Hyperthermie). Unterschieden wurden die fraglichen Allele durch gezielt eingefügte 3'-Primer-Mismatche.
  2. Prof. Dr. Schmitz (Inst. für Hygiene, Universität Düsseldorf) arbeitete an MRSAs (Meticillin resistente Staphylococcus aureus Stämme), die zudem meist multi-resistent gegen Antibiotika sind. Er verwendete Oberflächenantigene zu ihrer Typisierung. Im Rahmen einer Kollaboration mit ihm habe ich Protokolle und Primer entwickelt, um über PCR die fraglichen Fragmente zu amplifizieren und anschließend direkt zu sequenzieren. Die Analyse und das clustering der Sequenzen wurde ebenfalls von mir vorgenommen.
  3. 2003 habe ich als Berater für die Firma GeneLab GmbH, Gelsenkirchen, Testkits entwickelt. Da die Arbeiten der Vertraulichkeit unterliegen, seien hier nur die Themen angeführt:
    • Etablierung eines Tests zum Nachweis von Helicobacter pylori in menschlichen Faeces
    • Entwurf und Austestung eines Multiplex-PCR-Systems zur Detektion pathologischer Keime im menschlichen Mundraum.
    • Betreuung einer Diplomarbeit, in der Multiplex-PCRs entwickelt wurden zur parallelen Detektion von Mutationen, die Mucoviszidose verursachen, im menschlichen Genom.

-> zu den Publikationen


vps-Forschung

Am Biologisch-Medizinischen Forschungszentrum (BMFZ) der Universität Düsseldorf wird am vacuolären Protein-sorting (vps) gearbeitet. Eines der beteiligten Proteine, das Vps4p, war mir bereits zuvor aus meinen Sequenzanalysen bekannt, da es ein Mitglied der untersuchten AAA-Familie ist. Daher brachte ich in die Arbeitsgruppe die Information ein, dass dieses Protein in Hefe singulär, in Säugern jedoch in 2 paralogen Genen vorliegt. Daraufhin begannen wir 1998, aus Mensch und Maus, ausgehend von meinen Sequenzanalysen, genomische sowie cDNA-Klone zu isolieren und zu sequenzieren. Es folgten u.a. 2-Hybrid-Analysen, Fusionskonstrukte für die Cytologie. Mittlerweile ist die differenzielle Expression der beiden Paralogen in verschiedenen Mensch- und Mausgeweben untersucht, es sind Interaktionspartner bekannt und die zelluläre Lokalisation der beiden Paralogen geklärt.

-> zu den Publikationen


Das cDNA-Projekt

Von 1997 bis 2004 habe ich am BMFZ an der Universität Düsseldorf eine letztendlich 4-köpfige Arbeitsgruppe aufgebaut. Das Projekt "Deutsches cDNA-Konsortium" lief im Rahmen des "Deutschen Humangenom-Projekts" bzw. seit 2001 des "Nationalen Genom-Forschungsnetzes (DHGP bzw. NGFN) als ein Industrie-Hochschul-Verbundprojekt: Die Aufgabe war, eine Hochdurchsatz-Pipeline zu etablieren mit den Bestandteilen cDNA-Klonpräparation, Ansequenzierung, Datenmanagement, Qualitätskontrolle, Generierung hoch-qualitativer Komplettsequenzen (<0,001% errors) per "primer-walk". Dazu wurden Pipettierroboter eingebunden und programmiert, Datenbanken eingerichtet, Kapillarsequencer beschafft und deren Betrieb etabliert sowie Klon- und Sequenzverwaltungssysteme entwickelt. Das Endresultat war eine (physische wie Sequenz-) Klonbank mit 50.000 Klonen, von denen über 2.000 Stück komplett sequenziert wurden, in der Summe 9,6 MBp Doppelstrangsequenz.

Ende 2004 war die dritte Phase des cDNA-Konsortiums abgeschlossen uns somit meine Arbeit beendet.

-> zu den Publikationen

-> zur Seite des cDNA-Projekts

-> weitere Info cDNA-Projekt


Forschung in der Reinigungstechnologie

Von 11/2004 bis 10/2005 habe ich am wfk-Institut für Reinigungstechnologie als Projektleiter das BMBF-Forschungsprojekt "Normengerechte Aufbereitung von OP-Textilien" geleitet. Die Problemstellung ist folgende: Mehr und mehr nimmt auch im Gesundheitswesen der Trend zu, Aufgaben an externe Dienstleister zu übertragen ("outsourcing"). Daher wird mittlerweile die Berufsbekleidung der Krankenhausbediensteten fast ausschließlich von textilen Dienstleistern geleast. Letztere stehen einerseits unter dem wirtschaftlichen Druck, mit ihren Produkten eine möglichst hohe Anzahl von Umlaufzyklen zu gewährleisten, dabei jedoch andererseits die hohen vorgeschriebenen Qualitätsstandards (z.B. DIN EN 13795 OP-Textilien und die darin verwiesenen, weiteren Normen) einzuhalten. Im Rahmen des besagten Projekts haben sich Waschmittelhersteller, Produzenten von industriellen Waschmaschinen und OP-Textilien sowie das wfk-Forschungsinstitut zusammen geschlossen, um die Grenzen der Wiederaufarbeitungsfähigkeit verschiedener textiler Materialien im Rahmen der durch die betreffenden Normen definierten Grenzwerte zu ermitteln. Parallel dazu erfolgte eine Optimierung der Prozessparameter (Waschparameter) sowie der Textilien.

Mikrobiologie und Nanotechnologie<

Zu meinen Aufgaben an der wfk gehörte auch die Planung, Entwicklung und Beantragung von neuen Forschungsprojekten. Folgende Projekte habe ich entwickelt:

  1. Ölabbau in Wäschereien durch Bakterien:
    Insbesondere in Blauzeug-Wäschereien (z.B. Berufsbekleidung aus der Metall-verarbeitenden Industrie) können Kohlenwasserstoffmengen in der Größenordnung Kubikmeter / Tag im Abwasser anfallen. Das schafft Probleme mit der Abwasserverordnung (Anh. 55 Wäschereien); daneben werden die Textilien durch die notwendigen, harten Waschbedingungen über Gebühr geschädigt. Im beantragten Projekt soll untersucht werden, ob eine über-Nacht-Vorbehandlung mit Alkan- metabolisierenden Bakterein die Kohlenwasserstofflast des Abwassers reduzieren kann.
  2. Oberflächenbeschichtung von Wasserleitern mit Nanopartikeln:
    In Wassersystemen sind Biofilme ein erhebliches Problem. Die von den Bakterien gebildete Matrix schirmt die Biozönose ab und verhindert ihre Abtötung. Im Forschungsprojekt soll untersucht werden, ob eine Nano-Beschichtung (mit und ohne Nanosilber) die Bildung von Biofilmen verhindern kann.
  3. Oberflächenbeschichtung / Reinigung medizinischer Instrumente:
    Medizinische Instrumente, insbesondere solche, die im Kontext minimal-invasiver Methoden zum Einsatz kommen, stellen durch die in ihnen enthaltenen Hohlräume und ihren verwinkelten Aufbau ein erhebliches, hygienisches Problem dar. Im Projekt soll
    a) untersucht werden, inwieweit eine Oberflächenbeschichtung der Verschmutzung vorbeugen (oder sie zumindest abmildern) kann und
    b) ob ein Reinigungsverfahren mit Mikro- oder Nanopartikeln effizienter sein könnte als die herkömmlichen Methoden.

-> Zur Internetseite des wfk-Instituts für Reinigungstechnologie


Molekulare Diagnostik

Von 11/2005 bis 10/2006 habe ich am Medizinischen Hochschulinstitut GmbH (ein "An-Institut" an der FH Gelsenkirchen, Standort Recklinghausen, im Konsortium mit Fa. ogham GmbH, Münster) eine F & E Gruppe aufgebaut. Mehrere Projekte wurden aufgelegt und vorangetrieben:

  1. Diagnostik von Diarhhoe-Erregern:
    Diarrhoe, hierzulande hauptsächlich bei Reiseheimkehrern und (immun-)geschwächten Personen, kann lebensbedrohliche Ausmaße annahmen. Im Akutfall kann es daher von höchster Wichtigkeit sein, die Natur des Erregers - Virus, Bakterium oder eukaryoter Einzeller, in seltenen Fällen auch Würmer - schnell und präzise zu diagnostizieren. Hierzu wurde ein auf PCR-Amplifikation von Sequenzen der 16S-like rDNA und deren spezifischer Detektion per DNA-Chip beruhendes Multiplex-System entwickelt.
  2. Diagnostik genetischer Risikofaktoren:
    In den letzten Dekaden hat sicher heraus gestellt, dass Krebs, Empfindlichkeit / Empfänglichkeit gegenüber Chemotherapie, Neigung zu Sepsis, Atopie und Bluthochdruck von einem komplexen Netzwerk aus äußeren und inneren Faktoren - unter letzteren auch genetische - verursacht werden. Zu den genannten Themenbereichen wurde zunächst eine umfassende Literaturrecherche durchgeführt; deren Ergebnisse - also die Daten zu relevanten sinle nucleotide polymorphisms, SNPs - wurden in eine von mir eigens dazu entwickelte Datenbank eingepflegt. Anschließend wurden ARMS-PCR-Systeme zur Diagnose der als relevant beurteilten SNPs entwickelt und ausgetestet.
  3. Diagnostik von Influenza-Varianten:
    Influenzaviren existieren in 16 (Haemagglutinin-Gen) bzw. 8 (Neuraminidase-Gen) Varianten, jede davon wiederum in Hunderten von Subtypen. Nur bestimmte Kombinationen können für den Menschen gefährlich werden, so dass es im Verdachtsfall wichtig ist, den Subtyp so schnell wie möglich diagnostizieren zu können. Hierzu wurde eine breit angelegte Sequenzanalyse durchgeführt, um Gruppen- und Subgruppen-spezifische Konservierungsmuster zu identifizieren.

Die Arbeit am Medzinischen Hochschulinstitut konnte leider nicht fortgeführt werden, weil die Firma insolvent wurde.


Öffentlichkeitsarbeit

Ein großes Problem die Biowissenschaften betreffend ist das Bild der "life science" in der Öffentlichkeit. Die Diskussion solcher Themen wie Gentechnologie, Stammzellen, Klonen etc. ist i.d.R. geprägt von vielen Emotionen und wenig Wissen. Dabei vertrete ich eine "balancierte Position", die sich sowohl von einem strikt materialistischen Standpunkt, aber erst recht von fundamentalistisch-religiösen Positionen deutlich unterscheidet.

-> Beispiele (Bioethik)

-> Rezensionen

-> Internetseite der AG Evolutionsbiologie

-> Publikationen im Themenbereich Evolution